Стерилізація початкового рослинного матеріалу

Предыдущая234567891011121314151617Следующая

(по Р.Г.Бутенко, 1999)

Об'єкт Час стерилізації, хв
діацид 0,1 %-ний сулема 0,1 %-на перекис водню, 10-12%-ний
Насіння сухе 15-20 10-15 12-15
Насіння набрякле 6-10 6-8 6-8
Тканини стебла 20-40 20-25 -
Листя 1-3 0,5-3 3-5
Апекси 1-10 0,5-7 2-7

Після витримки експлантів в дезинфікуючому розчині їх кілька разів промивають у дистильованій воді і скальпелем удаляють зовнішній шар клітин на зрізах експлантів, оскільки він може бути пошкоджений при стерилізації.

Мікроорганізми можуть знаходитися і всередині рослинної тканини. Найчастіше внутрішнє інфікування зустрічається у тропічних і субтропічних рослин. Тому окрім поверхневої стерилізації іноді доводиться застосовувати антибіотики, які і вбивають мікробну флору усередині тканини. Слідує, проте, відмітити, що подібна обробка не завжди приводить до стерилізації внутрішніх тканин, оскільки важко вибрати антибіотик, що направлено діє.

Живильні середовища.Ізольовані клітини і тканини культивують на багатокомпонентних живильних середовищах. Вони можуть істотно розрізнятися по своєму складу, проте, до складу всіх середовищ обов'язково входять необхідні рослинам макро- і мікроелементи, вуглеводи, вітаміни, фітогормони і їх синтетичні аналоги. Вуглеводи (звичайно це сахароза або глюкоза) входять до складу будь-якої живильної суміші в концентрації 2 - 3%. Вони необхідні як живильний компонент, оскільки більшість калусних тканин позбавлена хлорофілу і не здатні до автотрофного живлення. Тому їх вирощують в умовах розсіяного освітлення абов темноті. Винятком є калусна тканина мандрагори, амаранта і деяких інших рослин.

Обов'язковими компонентами живильних середовищ мають бути ауксини, що викликають дедіференцировку клітин експланта, і цитокініни, що індукують поділ клітин. При зміні співвідношення між цими фітогормонами або при додаванні інших фігогормонів можуть бути викликані різні типи морфогенезу.

Японськими вченими Табата, Фуруя було встановлено, що біосинтез нікотину та інших алкалоїдів (анатабину, анабазину) можна регулювати в калусних тканинах будь-якого, в тому числі стеблового, походження екзогенними стимуляторами росту. Зокрема, в калусній культурі тютюну стеблового походження біосинтез нікотину підвищують, вилучаючи із середовища синтетичний ауксин 2,4-Д і збільшуючи концентрацію кінетину, синтез алкалоїдів (нікотину, анатабину, анабазину), а також деяких кумаринів активує ІОК і пригнічує 2,4-Д.

Високий вміст нітратів, іонів амонія, калія, фосфату сприяє швидкому росту клітин. Виснаження середовища значно знижує ріст і процеси вторинного метаболізму. Проте спочатку низький вміст фосфатів в живильному середовищі здатний стимулювати синтез вторинних метаболітов. Встановлено, що культивування калусів солодки голою на середовищі з половинною концентрацією азоту і фосфору в темноті збільшує зміст фенольних сполук в 1,6 разу в порівнянні з калусами, що росли на повному середовищі. В середовище можуть бути додані ендосперми незрілих зародків (кокосовий горіх, кінський каштан і ін.), пасока деяких дерев, різні екстракти (солодовий, дріжджовий, томатний сік). Введення їх в середовище дає цікаві результати, але такі експерименти важко відтворювані, оскільки компонент, що діє, як правило, точно невідомий. Наприклад, додавання в живильне середовище окремих фракцій кокосового молока не давало ніяких результатів, тоді як нефракціонований ендосперм викликав поділ клітин.



При приготуванні твердих живильних середовищ для поверхневого вирощування калусних тканин використовують очищений агар-агар - полісахарид, що отримується з морських водоростей.

Середовище Мурасіге і Скуга - найбільш універсальне. Воно придатне для утворення калусів, підтримки неорганізованого калусного росту, індукції морфогенезу у більшості дводольних рослин. Так, зміна співвідношення ауксина і кінетина приводить до утворення або коріння (переважання ауксина), або стеблових культур (переважання кінетина).

Середовище Гамборга і Евелега добре підходить для культивування клітин і тканин бобових рослин і злаків, середовище Уайта забезпечує вкорінення пагонів і нормальний ріст стебла після регенерації, а середовище Ніча і Ніч придатне для індукції морфогенезу в культурі пиляків.

Внесення в живильне середовище аргініну і орнітину підсилює ріст культури коренів беладони Аtrора bеlаdоппа і збільшує в ній вміст алкалоїдів на 60 %. Однак в культурі тканин махоркине спостерігалося збільшення кількості алкалоїдів після внесення в живильне середовище таких попередників біосинтезу, як лізин, орнітин і нікотинова кислота. На кількість і динаміку накопичення, наприклад, тропанових алкалоїдів в суспензійній культурі з листка дурману звичайного впливають не лише попередники (фенілаланін, орнітин), а й стимулятори росту (кокосове молоко, дріжджовий екстракт) та час їх внесення в середовище.

Фізичні чинники.На зростання і розвиток рослинних тканин in vitro великий вплив мають фізичні чинники - світло, температура, аерація, вологість.

Світло. Більшість калусних тканин можуть рости в умовах слабкого освітлення або в темноті, оскільки вони не здатні фотосинтезувати. Разом з тим світло може виступати як чинник, що забезпечує морфогенез і що активує процеси вторинного синтезу.

Таблиця

Склад живильних середовищ, що використовуються при культивуванні клітин і тканин(по Р. Р. Бутенко, 1999)

Компонент середовища Концентрація, мг/л
Мурасіге і Скуга Гамборга і Евелега Уайта Ніча і Ніч
KNO3
NH4NO3 - -
Ca(NO3)2 - - -
Ca(NO3)2•4H2O - - - -
(NH4 )2SO4 - - -
CaCl2•H2O - - -
CaCl2•2H2O - -
KCl - - -
KH2PO4 -
NaH2PO4•H2O - - -
MnSO4•H2O - - -
MnSO4•4H2O 22,3 - -
ZnSO4•4H2O 8,6 - - -
ZnSO4•7H2O - -
H3BO4 6,2 -
CuSO4•5H2O 0,025 0,075 - 0,025
Na2MoO4•2H2O 0,25 0,25 - 0,25
CoCl2•6H2O 0,025 - - -
FeSO4•7H2O 27,8 - - 27,8
NaEDTA•2H2O 37,3 - - 37,3
Секвестрен 330-Fe - - -
Мезоінозит - -
Аскорбінова кислота - - -
Тіамін-HCl 0,5
Піридоксин-HCl 0,5
Нікотинова кислота 0,5 -
Сахароза
Агар «Дифко», гельрит, агароза - - -

Як джерело світла використовують люмінесцентні лампи. Для більшості трав'янистих рослин оптимум освітленості складає приблизно 1000 люкс. Дуже низька (300 люкс) або висока (3000- 10 000 люкс) освітленість пригнічує зростання. Освітлення може впливати на метаболізм каллусних клітин. Так, в культурах чайної рослини під дією світла збільшувався біосинтез поліфенолов. Навпаки, в культурі клітин Scopoliaparvi-flora світло пригнічувало утворення алкалоїдів. Окрім ііітенсивності освітленості на культуру тканини і її фізіологічні особливості впливає якість світла. Так, більше 20 флавонів флавонолових глікозидів утворюється в культурах клітин петрушки після освітлення її безперервним люмінесцентним світлом «холодний білий». Разом з тим синтез флавонових глікозидів активується при послідовному опромінюванні ультрафіолетовим світлом, а потім світлом, лежачим в області «красний-длінноволновий червоний».

Синтез антоціанів в культивованих клітинах залежить як від інтенсивності освітлення, так і від його спектральної характеристики. Наприклад, в калусних культурах гаплопапусу утворення антоціану індукується синім і ультрафіолетовим світлом. Однак наявність в середовищі гіберелової кислоти в період освітлення синім світлом повністю пригнічує утворення антоціанів.

Температура. Для більшості калусних культур оптимальна температура 26 °С. В той же час калуси і культури клітин діоскореї дельтовидної добре ростуть навіть при температурі 32°С. На відміну від зростання культур клітин і тканин індукція їх морфогенезу вимагає нижчих температур (18-20°С). Вплив температури на метаболізм клітин in vitro вивчений слабо. Є дані, що в калусних культурах максимальне утворення алкалоїдів спостерігалося при температурі 25°С, а при підвищенні температури різко знижувалося. У суспензійних культурах клітин Ipomoea вміст жирних кислот значно збільшувався, якщо їх вирощували при субоптимальних температурах зростання (15°С). Тому при вирощуванні культури in vitro необхідно ретельно вивчати вплив всіх абіотичних чинників, зокрема температурного, на ріст і метаболізм клітин.

Наприклад, синтез у клітинах флавоноїдів у флоемі експлантів коренеплоду моркви індукується короткочасною обробкою холодом, наслідком чого є утворення яскраво-червоного калусу на середовищі із сахарозою.

Аерація. Для вирощування суспензійних культур велике значення має аерація. Особливо важливе постачання повітрям культивованих клітин у великих об'ємах ферментерів.

При порівнянні різних типів ферментерів було доказано, що синтез вторинних метаболітів в суспензійній культурі був найбільшим при подачі повітря знизу. При вирощуванні клітин в малих об'ємах (у колбах) нормальна аерація досягається при постійному перемішуванні суспензії.

Вологість. Оптимальна вологість в приміщенні, де ростуть культури, повинна складати 60 - 70%.

Таким чином, культивування клітин і тканин залежить від багатьох чинників зовнішнього середовища, і дія їх не завжди чітко відома. Тому при введенні в культуру нового виду рослини необхідно перш за все ретельно вивчити вплив фізичних чинників на ріст і фізіологічні характеристики цієї культури.


0391825557064860.html
0391879979431004.html
    PR.RU™